عناصر ضروری برای بیان ژن های نوترکیب کلون شده

 

قبل ازکلون نمودن یک ژن جهت بیان آن ابتدا تعیین نماییم که برای بیان یک ژن در یک وکتوری به چه المنت‌هایی نیاز می باشد این المنت‌ها در شکل فوق نمایش داده شده است

Promoter: اولین المنت موردنیاز برای بیان ژن ها پروموتر ها می‌باشند که برای رونویسی از ژن نیاز هستند. برای باکتری‌ها، مهره‌داران، مخمرها، حشرات و … پروموترهای متنوعی وجود دارد. از آنجایی که توالی پروموتر در بین موجودات مختلف می باشد، اگر قصد بیان ژن هدف در یک موجود را دارید باید از پروموتر مختص آن گونه استفاده نمایید.

کدون آغازین (start codon): کدون آغازین که اغلب ATG (کد کننده متیونین) می باشد برای شروع ترجمه کاملاً ضروری می باشد و علاوه بر شروع ترجمه، چهارچوب خوانش را نیز تعیین می‌نماید

توالی CDS یا ژن مورد نظر: ترجمه این توالی سبب سنتز پروتئین می شود. کل توالی ژن باید در یک چهارچوب خواندن باز (ORF) کلون شده باشد. علاوه بر این ارجحیت کدونی باید در این توالی رعایت شده باشد.

کدون خاتمه (stop codon): در کد ژنتیکی، کدون خاتمه یک ترکیب سه تایی نوکلئوتیدی درون یک messenger RNA است که پایان فرایند ترجمه را اعلام می‌کند وجود این کدون برای اتمام ترجمه در نقطه مناسب نیاز می باشد. کدون های خاتمه شامل توالی های TAG، TAA و TGA می شود.

جایگاه اتمام رونویسی (terminator): وجود این جایگاه برای اتمام رونویسی در نقطه مناسب ضروری می‌باشد. Terminator در یوکاریوت ها معمولا جایگاه آغاز پلی ادنیلاسیون mRNA می باشد که به آن جایگاه ploly A نیز گفته می شود. در این ناحیه یک دم poly A به mRNA سنتز شده اضافه می شود که برای ترجمه و پایداری mRNA لازم می باشد.

نقش توالی اتصال ریبوزوم (RBS) در کلون نمودن و بیان ژن های نوترکیب

ناحیه اتصال ریبوزوم (RBS): بعد از رونویسی از ژن ها باید ترجمه توسط ریبوزوم‌ها صورت پذیرد بنابراین باید جایگاهی برای اتصال محکم ریبوزوم در ناحیه شروع ترجمه فراهم باشد در غیر این صورت ترجمه آغاز نخواهد شد و یا کارایی کافی را نخواهد داشت. در انسان و بسیاری از گونه‌ها توالی کوزاک یک جایگاه اتصال ریبوزوم بسیار قوی می باشد که برای بیان ژن ها در این گونه به کار می‌رود (همیشه برای بیان ژن ها در انسان و سایر گونه‌ها به توالی کوزاک نیازی نیست اما استفاده از آن سبب افزایش نرخ ترجمه خواهد شد).

توالی جایگاه اتصال ریبوزوم در گونه‌های مختلف متفاوت می باشد و برخی از گونه‌ها حضور کدون آغازین برای شروع ترجمه کفایت می‌نماید که این نکته باید با توجه به مقالات تعیین شود.

توالی شاین دالگارنو (Shine-Dalgarno sequence) چیست و چه کاربردی در کلون نمودن و بیان ژن ها در باکتری ها دارد

 

جایگاه اتصال ریبوزوم در باکتری‌ها توالی Shine-Dalgarno (SD) می باشد که معمولا 8 نوکلئوتید بالادست کدون آغاز قرار دارد. معمولا بسیاری از وکتورهایی که برای بیان ژن ها در باکتری‌ها طراحی شده اند دارای توالی Shine-Dalgarno (SD) در ساختار خود می‌باشند شکل فوق قسمت A یک وکتور pET را نشان می‌دهد که دارای توالی Shine-Dalgarno (SD) بعد از پروموتر می باشد بنابراین نیازی به افزودن این توالی بر روی توالی insert نمی‌باشد. قسمت B نیز ژنی را نشان می‌دهد که بعد از توالی Shine-Dalgarno (SD) کلون شده است.

 

 

در شکل فوق نیز می‌توانید مشاهده نمایید که برای انواع وکتور PET یک جایگاه RBS قرار دارد

ما در این آموزش قصد نداریم بگوییم از چه توالی ای برای جایگاه اتصال ریبوزوم استفاده نمایید زیرا هر ژن، هر گونه و به طور خاص هر کلونینگ دارای شرایط خاص می باشد که بهترین شرایط را باید از مقالات مربوطه استخراج نمایید.

برای انتخاب جایگاه RBS مناسب به نکات زیر توجه نمایید:

توالی RBS به‌گونه‌ای که باید بیان در آن صورت پذیرد تعلق داشته باشد

فاصله توالی RBS تا کدون آغازین مهم می باشد.

ساختار سه بعدی RNA در فاصله توالی RBS تا کدون آغازین مؤثر می‌باشد و توالی RBS و کدون آغازین نباید در ساختار ثانویه قرار بگیرند.

توالی کوزاک (Kozak sequence) چیست و چه کاربردی در کلون نمودن ژن ها و بیان ژن ها در یوکاریوت ها دارد

در یوکاریوت ها وجود cap در mRNA سبب اتصال ریبوزوم می گردد اما وجود برخی از توالی ها مانند توالی کوزاک می‌تواند میزان بیان ژن ها را افزایش دهد. توالی کوزاک در پستانداران به صورت gccRccATGg می باشد که ATG همان کدون آغازین ترجمه می باشد که می‌توان از آن برای شروع ترجمه استفاده نمود. البته در برخی از موارد علاوه بر ATG توالی کوزاک از یک ATG دیگر نیز در نزدیکی این توالی استفاده می نمایند در مورد استفاده نمودن و یا استفاده ننمودن از توالی کوزاک برای افزایش بیان ژن ها و شرایط استفاده از آن مقالات بسیاری موجود می باشد برخی از ژن ها برای بیان به توالی کوزاک نیاز ندارند اما وجود توالی کوزاک سبب افزایش بیان آن‌ها می شود. برخی نیز بدون وجود این توالی بیان خوبی دارند.

در اغلب وکتورهایی که برای بیان ژن ها به کار می‌رود پروموتر و جایگاه خاتمه رونویسی مانند جایگاه پلی آدنیلاسیون بر روی وکتور قرار دارد. اما در کلون نمودن توالی ها برای بیان ژن باید وجود سایر عوامل بر روی توالی insert یا وکتور بررسی شود.

 

------------------------------------------

 منبع :pishgam-bio.ir